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Transformação & seleção bacteriana
Google Sala de AulaTransferência de DNA plasmidial para bactérias. Como as bactérias são selecionadas. Produção e purificação de proteínas.
Pontos Principais:
- As bactérias podem incorporar DNA exógeno em um processo denominado transformação.
- A transformação é um passo fundamental na clonagem de DNA. Ocorre após clivagem e ligação e transfere plasmídeos recém-criados para bactérias.
- Após a transformação, as bactérias são selecionadas em lâminas antibióticas. As bactérias com um plasmídeo são resistentes a antibióticos e cada uma formará uma colônia.
- As colônias com o plasmídeo sicerto podem ser cultivadas para formar grandes culturas de bactérias idênticas, que são usadas para produzir plasmídeo ou sintetizar proteína.
Visão geral: clonagem de DNA
A transformação e seleção bacteriana são passos fundamentais na clonagem de DNA. Clonagem de DNA é o processo de fazer muitas cópias de uma parte específica do DNA, como um gene. Frequentemente as cópias são feitas em bactérias.
Em um experimento típico de clonagem, os pesquisadores primeiramente introduzem um pedaço de DNA, como um gene, em um pedaço circular de DNA denominado plasmídeo. Esta etapa utiliza enzimas de restrição e DNA ligase e é denominada ligação.
Após uma ligação, o próximo passo é transferir o DNA para as bactérias, em um processo denominado transformação. Então, podemos usar métodos de seleção de antibióticos e análise de DNA para identificar as bactérias que contém o plasmídeo que procuramos.
Passos da transformação e seleção bacteriana
Este é um procedimento típico de transformação e seleção bacteriana:
- Bactérias especialmente preparadas são misturadas com DNA (ex., de uma ligação).
- Um choque térmico é dado nas bactérias, o que faz com que algumas delas incorporem um plasmídeo.
- Os plasmídeos usados na clonagem contém um gene para resistência a antibiótico. Desta forma, todas as bactérias são colocadas em uma lâmina de antibiótico para selecionar aquelas que incorporaram um plasmídeo.
- Bactérias sem um plasmídeo morrem. Cada bactéria com um plasmídeo dá origem a um aglomerado de bactérias idênticas, contendo plasmídeo, que são denominadas de colônia.
- Várias colônias são verificadas para identificar uma com o plasmídeo correto (por exemplo, por PCR ou digestões de restrição).
- Uma colônia contendo o plasmídeo correto cresce em volume e é usada para a produção de plasmídeo ou proteína.
Por que precisamos verificar as colônias?
Todas as bactérias que formam colônias deveriam conter um plasmídeo (que fornece resistência a antibióticos). Entretanto, não necessariamente todas as colônias contendo plasmídeos terão o mesmo plasmídeo.
Como isso funciona? Quando cortamos e colamos o DNA, muitas vezes é possível formar produtos secundários, além do plasmídeo que pretendemos construir. Por exemplo, quando tentamos inserir um gene em um plasmídeo usando uma enzima de restrição específica, é possível que em alguns casos o plasmídeo se feche (sem absorver o gene), e em outros casos o gene entre ao contrário.
Por que importa se um gene entra em um plasmídeo ao contrário? Em alguns casos, não importa. Entretanto, se queremos expressar o gene em bactérias para produzir uma proteína, o gene deve apontar na direção correta em relação ao promotor, ou na sequência de controle que conduz a expressão do gene. Se o gene estiver ao contrário, a fita errada de DNA seria transcrita e não seria produzida proteína .
Por causa destas possibilidades, é importante coletar DNA plasmidial de cada colônia e verificar se combina com o plasmídeo que estamos tentando gerar. Classificações de restrição, PCR, e sequenciamento de DNA são comumente usados para analisar DNA plasmidial de colônias bacterianas.
Produção de proteína em bactérias
Suponha que identificamos uma colônia com plasmídeos "bons". O que acontece a seguir? Qual a razão de toda esta transformação, seleção e análise?
Possibilidade 1: Bactérias = fábricas de plasmídeos
Em alguns casos, as bactérias são simplesmente usadas como "fábricas de plasmídeos", gerando muito DNA plasmidial. O DNA plasmidial poderá ser usado em etapas adicionais de clonagem de DNA (por exemplo, gerar plasmídeos mais complexos) ou em vários tipos de experimentos.
Em alguns casos, os plasmídeos são usados diretamente para propósitos práticos. Por exemplo, plasmídeos foram usados para levar um gene humano ao tecido pulmonar em um recente estudo clínico de terapia genética para pacientes com fibrose cística de origem genética.
Possibilidade 2: Bactérias = fábricas de proteína
Em outros casos, as bactérias podem ser usadas como fábricas de proteínas. Se um plasmídeo contém as sequências de controle corretas, as bactérias poderiam ser induzidas a expressar o gene que contém quando um um sinal químico é adicionado. A expressão do gene leva à produção de RNAm, que é traduzido em proteína. As bactérias podem então ser lisadas (abertas) para liberar a proteína.
As bactérias contêm muitas proteínas e macromoléculas. Por conta disto, a recém-formada proteína precisa ser purificada (separada de outras proteínas e macromoléculas) antes de poder ser utilizada. Existe uma variedade de diferentes técnicas utilizadas para a purificação de proteína.
Em uma técnica chamada de cromatografia de afinidade, uma mistura de moléculas extraídas das bactérias decompostas é vertida em uma coluna, ou em um cilindro repleto de grânulos. Os grânulos são revestidos com um anticorpo, uma proteína do sistema imunológico que se liga especificamente a uma molécula alvo.
O anticorpo na coluna é projetado para ligar-se à proteína de interesse, e não a quaisquer outras moléculas da mistura. Desta forma, a proteína de interesse fica presa na coluna, enquanto as outras moléculas são arrastadas. Na etapa final, a proteína de interesse é liberada da coluna e coletada para o uso.
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