Sequenciamento de DNA

RKA4JL - Olá! Tudo bem com você? Você vai assistir agora a mais uma aula de Ciências da Natureza. Nesta aula vamos conversar sobre o sequenciamento de DNA. Você já se perguntou sobre como sequenciamos o DNA? Bem, vamos dar uma rápida olhada aqui no sequenciamento de DNA, que é dividido em três etapas básicas, e vamos dar uma olhada em cada uma delas. Na primeira etapa do processo, a gente pega uma amostra de DNA em que estamos interessados em sequenciar e usamos PCR para amplificar a amostra. Ao usar o PCR para amplificar a amostra, somos capazes de gerar muitos e muitos fragmentos de DNA. A próxima coisa a ser feita é adicionar nucleotídeos ainda no PCR, ou seja, dar à fita em crescimento o substrato a partir do qual ela pode crescer. Normalmente adicionamos desoxinucleotídeos regulares e eles se parecem com isso aqui. Nós temos um grupo OH aqui, e aqui temos um grupo H. Também temos uma base, um grupo de carbono, e oxigênio e hidrogênio. Então é assim que o nucleotídeo normal se parece. Mas intercalado no PCR também precisamos adicionar algo conhecido como didesoxinucleotídeo. Um didesoxinucleotídeo se parece com isso. É basicamente a mesma coisa, mas só tem um hidrogênio aqui. Esse oxigênio é removido, e o que isso, que nós podemos abreviar como ddNTP, faz é que se ele se incorporar na fita em crescimento, uma vez que não há grupo de oxigênio aqui, a fita não pode mais se alongar. E então, basicamente, temos a terminação do alongamento da fita assim que esse ddNTP se incorpora. O que podemos fazer também é marcar com fluorescência os diferentes de desoxinucleotídeos. Nós temos quatro opções diferentes. Podemos marcar todos os G de azul, podemos marcar também todos os A de vermelho, todos os T de verde e todos os C de laranja. Então, basicamente, teremos esses didesoxinucleotídeos com diferentes marcações florescentes sendo incorporados na fita em crescimento. Uma vez que o PCR é capaz de amplificar, criando milhões e milhões de fragmentos de DNA, teremos como resultado diversas fitas com diferentes comprimentos. Vamos dar uma olhada em um exemplo para entender isso legal? Vamos imaginar que temos um nucleotídeo sendo incorporado aqui, em um nucleotídeo regular, e depois outro sendo incorporado aqui e aleatoriamente, de repente, nós temos um didesoxinucleotídeo sendo incorporado aqui. Isso interromperia o alongamento da fita. Teríamos com isso uma fita de DNA com apenas quatro nucleotídeos de comprimento. Depois de outra rodada de PCR, poderíamos ter aqui um, dois, três, quatro, cinco, seis. Está apenas crescendo, crescendo, e de repente temos um didesoxinucleotídeo sendo incorporado. Então, basicamente, fazemos apenas isso e depois de ter milhões e milhões de amostras, seremos eventualmente capazes de ter algo parecido com isso. Teremos, talvez, um único nucleotídeo regular e um didesoxinucleotídeo incorporado, ou poderemos ter, talvez, dois deles e então teremos um didesoxinucleotídeo. Vamos usar esse conjunto de cores que temos aqui? Repare que teremos várias fitas em crescimento e com diversos tamanhos que serão terminados em pontos diferentes por um desoxinucleotídeo. Depois de fazer isso chegamos à terceira etapa em que realizamos a eletroforese em gel para separar as fitas por tamanho. Quando executamos todos os diferentes fragmentos em um gel, vamos separá-los por tamanho e então basta pedir a um computador para analisar todas as marcações fluorescentes. Então se ele vier aqui onde temos essa luz fluorescente azul, ele vai saber que o segundo nucleotídeo na sequência terá G, então ele vai dar como resposta um G. Assim, ao olhar aqui, ele vai dizer que isso é um C aqui ele vai dizer que temos outro G, e assim por diante. Então, basicamente, o computador vai ser capaz de ler essas marcações fluorescentes e dar a você uma sequência de DNA. Essa é, basicamente, a visão geral de como funciona o sequenciamento de DNA. Eu espero que você tenha compreendido tudo direitinho aqui e mais uma vez eu quero deixar para você um grande abraço e dizer que encontro você na próxima!